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免疫細胞化學故障排除

更新時間:2023-08-15      點擊次數:813

故障排除

以下故障排除指南旨在解釋免疫細胞化學/免疫熒光 (ICC/IF) 染色中觀察到的常見問題的原因和可能的解決方案。

沒信號

抗體應用

增加一抗或二抗的濃度或孵育時間。

透化緩沖液

  • 使用適當的透化試劑進行靶蛋白的定位。 Triton 去污劑對于線粒體或核蛋白是必需的,但會溶解外膜并破壞正確的膜定位。

  • 增加孵育時間或洗滌劑濃度。

細胞固定

  • 過度固定可能會導致表位掩蔽。減少固定劑的時間或濃度。

抗體相容性

  • 通過檢查物種反應性來確認您的一抗和二抗是否兼容。

  • 確認抗體可用于蛋白質處于天然構象的測定。

  • 通過使用陽性對照初級濾光片,確保次級濾光片正常工作并與顯微鏡的濾光片組兼容。

目標可用性

  • 使用已知表達目的蛋白的過表達測定或陽性對照細胞系。

細胞干燥

  • 如果細胞干燥,熒光信號將會丟失。環蓋玻片涂有指甲油。

細胞活力

  • 在開始染色程序之前確認細胞活力。

顯微鏡調整

  • 增加相機的曝光時間。


背景

抗體濃度

  • 降低一抗/二抗的濃度。

阻塞

  • 增加封閉緩沖液中的孵育時間或血清濃度。使用封閉緩沖液稀釋一抗和二抗。

抗體應用

  • 始終將一抗在 4° C 下孵育過夜。室溫孵育會增加非特異性結合并導致更高的背景。

  • 通過在沒有初級的情況下進行測定,確認次級不會與細胞發生交叉反應。

污染文物

  • 確保載玻片清潔且無灰塵。緩沖液應新鮮配制,以防止微生物污染。

洗滌

  • 增加洗滌次數。對板進行非常溫和的攪拌。

  • 增加 PBS-T 中 Tween 的濃度。

光譜重疊

  • 如果對細胞進行雙重或三重標記,請確認二級細胞不會重疊到相同的光譜范圍內



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