概述 - 定量“實時"PCR 或 qPCR

定量實時 PCR 改變了我們測量核酸濃度的能力，并且是驗證微陣列分析和其他基因組技術(shù)生成的表達(dá)數(shù)據(jù)的重要一步。實時 qPCR 儀器的開發(fā)促進(jìn)了這一點，該儀器可測量反應(yīng)每個步驟或“實時"產(chǎn)生的 qPCR 產(chǎn)物的量。 SYBR green 因其相對簡單和可靠而成為目前流行的實時 PCR 方法。在實時 PCR 技術(shù)發(fā)展之前，定量測量需要設(shè)置多個 PCR 反應(yīng)，以便在擴(kuò)增的線性階段捕獲 qPCR 產(chǎn)物。然后通過凝膠電泳或 HPLC 進(jìn)行 PCR 產(chǎn)物的分離和定量。這些實驗非常費(fèi)力，并且實現(xiàn)正確定量所需的操作次數(shù)增加了引入錯誤的可能性。因此，能夠在每個熱循環(huán)測量 PCR 產(chǎn)物的實時 PCR 儀器的開發(fā)提高了定量 PCR 的簡便性、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。由于實時 PCR 的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了多種應(yīng)用。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的驗證，2) DNA 拷貝數(shù)的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達(dá)。實時 PCR 儀器的開發(fā)可以在每個熱循環(huán)中測量 PCR 產(chǎn)物，從而提高了定量 PCR 的簡便性、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。由于實時 PCR 的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了多種應(yīng)用。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的驗證，2) DNA 拷貝數(shù)的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達(dá)。實時 PCR 儀器的開發(fā)可以在每個熱循環(huán)中測量 PCR 產(chǎn)物，從而提高了定量 PCR 的簡便性、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。由于實時 PCR 的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了多種應(yīng)用。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的驗證，2) DNA 拷貝數(shù)的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達(dá)。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的驗證，2) DNA 拷貝數(shù)的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達(dá)。其中包括 1) 通過微陣列分析或下一代測序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的驗證，2) DNA 拷貝數(shù)的測量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達(dá)。

一般來說，實時 PCR 方案與標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)類似。同樣的問題也適用于生產(chǎn)干凈的模板、設(shè)計引物和優(yōu)化反應(yīng)條件。主要區(qū)別在于加入了 SYBR green 等嵌入劑或使用熒光引物來檢測 PCR 產(chǎn)物。在典型的反應(yīng)中，qPCR 產(chǎn)物的產(chǎn)生呈指數(shù)級增長。由于需要幾個循環(huán)才能輕松檢測到足夠的產(chǎn)物，因此熒光與循環(huán)數(shù)的圖呈現(xiàn) S 形外觀。在稍后的循環(huán)中，反應(yīng)底物耗盡，qPCR 產(chǎn)物不再加倍，并且曲線開始變平。曲線上熒光量開始快速增加的點，通常比基線高幾個標(biāo)準(zhǔn)差，稱為閾值循環(huán)（Ct 值）。 Ct 與模板的關(guān)系圖是線性的，因此比較多個反應(yīng)之間的 Ct 值可以計算出目標(biāo)核酸的濃度。這條線的斜率提供了 qPCR 效率的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

PCR產(chǎn)物可通過生成標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量或相對于對照基因進(jìn)行定量。基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時PCR定量可以利用質(zhì)粒DNA或其他形式的DNA，其中每個標(biāo)準(zhǔn)的絕對濃度是已知的。然而，必須確保標(biāo)準(zhǔn)品的 PCR 效率與“未知"樣品的 PCR 效率相同。在某些情況下，從純化的靶標(biāo)中進(jìn)行 PCR 比用復(fù)雜的核酸混合物觀察到的效率更高。相對定量方法稍微簡單一些，因為它需要測量管家或?qū)φ栈蛞允鼓繕?biāo)基因的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。然而，選擇適當(dāng)?shù)目刂苹蚩赡軙饐栴}，因為它們不一定在所有未知樣本中均等表達(dá)。這可以通過對一組管家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化測量來避免，以避免這種變異性問題。

進(jìn)行實時 PCR 的一個關(guān)鍵方面是從高純度的模板開始。在處理某些生物樣品時，這可能具有挑戰(zhàn)性。幸運(yùn)的是，已經(jīng)開發(fā)了許多商業(yè)產(chǎn)品來促進(jìn)高純度核酸的分離。去除污染性苯酚和不需要的 DNA 是需要考慮的步驟。對于基因表達(dá)研究，必須使用高純度試劑并多次重復(fù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，因為此步驟可能會引入模板復(fù)制的變異性。逆轉(zhuǎn)錄可以在實時PCR之前進(jìn)行，或者可以并入擴(kuò)增程序中。

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